独家专访中国学者《Cell》首发跨组织单细胞水平的肝癌免疫图谱
关键词/肝癌 单细胞测序
今晨，国际知名学术期刊《Cell》发布我国单细胞研究代表学者张泽民教授课题组的最新癌症研究成果：Landscape and Dynamics of Single Immune Cells in Hepatocellular Carcinoma。这是继2017年在《Cell》上发布肝癌微T细胞图谱，2018年在《Nature》、《Nature Medicine》上分别发布结直肠癌、肺癌单细胞图谱后，张泽民课题组首次发布跨组织单细胞水平的肝癌免疫图谱。论文作者第一时间接受了基因慧独家专访。
图1：参与研究人员合影，来源/张泽民课题组
2）北京大学BIOPIC和生命科学学院博士生张启明、北京大学前沿交叉学院博士生何尧和北京世纪坛医院博士生罗楠为该论文的并列第一作者，北京大学BIOPIC和生命科学学院任仙文副研究员、张泽民教授、勃林格殷格翰公司主任科学家刘康博士和北京世纪坛医院彭吉润教授为该论文的共同通讯作者。
3）肝癌单细胞数据已上传至交互式网站，可通以下网址查看：http://cancer-pku.cn:3838/HCC/
图2：本课题研究思路，来源/《Cell》
1）基于两种单细胞测序数据，本研究绘制了高分辨率的肝癌免疫图谱，包括T细胞、B细胞、NK细胞和髓系细胞等主要细胞类群以及主要类群下属的40类细胞亚群。腹水中的细胞类型表型出明显的特异性，其中髓系细胞主要来源于肿瘤中的巨噬细胞。
2）通过转录组测序，发现肝癌的巨噬细胞呈现两种状态：TAM-like和MDSC-like状态，前者表达的两个关键基因SLC40A1和GPNMB与预后不良有关，在细胞炎症反应中起重要作用。
3）在体外实验证实了LAMP3+ DC是成熟态的树突状细胞（也称DC细胞）， 且具有向肝淋巴结迁移和与多种淋巴细胞相互作用的潜在能力。
【基因慧】祝贺时隔一年在单细胞癌症免疫攻关上取得的突破进展！相对于2017年在《Cell》上发布的肝癌微T细胞图谱，2018年在《Nature》、《Nature Medicine》上发布结直肠癌和肺癌单细胞图谱，这次课题有什么重大发现呢？可以通俗地、概括性地分享一下吗？
2）结合两种单细胞测序技术平台：SMART-seq2和10x Genomics Chromium 3’，并整合两种转录组测序数据进行生物信息分析。
3）基于前沿的生物信息学分析方法RNA velocity和基于线粒体突变构建进化树。并通过CRISPR技术在THP-1诱导的巨噬细胞系中进行基因敲除和功能验证实验。
【基因慧】课题总体设计的思路是怎样的呢？
【文章共同第一作者张启明】本次课题设计在实验和数据分析方面都有所突破。从测序平台的选择来说，我们两种各具优势的测序技术10x Genomics和SMART-seq2，前者基于微滴包被的原理，可实现一次实验获得较多的细胞数量，有效降低了单细胞测序的实验成本；而后者测序技术则利用孔板对单个细胞进行实验，通量相对较低，但每个细胞的基因捕获率相对较高。我们通过整合这两种平台的数据进行生物信息学分析，充分发挥不同数据类型的优势，获得高分辨率的肝癌免疫图谱。
而就样本收集而言，癌旁组织和外周血是肿瘤相关研究中常用的对照组织，而其他相关的免疫器官或病理组织则较少受到关注。就像张老师提到过的，腹水是肝癌患者常见的病理现象，其产生与肝癌预后不良有关，然而腹水中的免疫细胞组成及其与肝癌的联系尚不清楚。因此，本研究收集肝癌病人的癌组织、癌旁组织、淋巴结、外周血和腹水五种组织的CD45+免疫细胞进行实验，并分析肝癌免疫微环境中的细胞类型、表达特征，以及不同组织之间细胞的动态变化与联系。
【文章共同第一作者何尧】在数据分析方面的设计思路是与实验相配合的。我们利用多组织、多平台这一特点，大胆尝试多种前沿的生物信息学分析方法，旨在充分挖掘数据中潜在的生物学意义。我们将不同平台数据相结合进行分析的方式充分发挥了不同类型数据的优势，而针对多组织这一特点选择的不同的路径追踪方法则利用了数据不同层面的信息，包括基因表达、可变剪接、线粒体突变等，来共同揭示组织之间的动态变化。我们的设计思路也可扩展到其他癌症的相关研究中。
【基因慧】继续选择肝癌这个癌种研究单细胞水平的免疫图谱，在技术层面可以谈谈相关原因吗？这对于后续诊断和治疗有哪些具体的指导意义呢？
【张泽民教授】中国是肝癌大国，攻克肝癌是我们这代人的使命。对肝癌的科学理解也需要阶段性。之前，我们为了简化科学问题，只关注了肿瘤中的T细胞特征，对肝癌免疫微环境缺少全面的刻画和理解。我们本项工作首次对肝癌临床样本进行包括病理组织在内的多组织位点的收集，并利用前沿的生物信息学分析方法，通过自体对照，不仅描述了肝癌微环境的免疫组分和状态，而且描绘了肿瘤浸润免疫细胞跨组织的动态过程。
这为后续开发新的临床检测与治疗方案提供了新的思路。例如，研究揭示了肿瘤中的巨噬细胞构成腹水中髓系细胞的主要来源。由于外周血的免疫特征与肿瘤中具有较大差异，而组织活检的取样难度相对较大，该结果为利用肝癌病人的腹水代替外周血或活检组织进行肿瘤免疫状态检测提供了新的思路。
针对巨噬细胞中与较差预后相关的基因GPNMB和SLC40A1，研究者通过揭示其在巨噬细胞中的炎症作用，为相关药物开发提供了潜在靶点。而研究发现的LAMP3+树突状细胞，可从肿瘤迁移到外周淋巴结，表达多种免疫配体基因，并具有与多种T淋巴细胞类型相互作用的潜力。这为后续进一步对该细胞类型进行研究和应用提供了基础，为通过调节免疫微环境进行肿瘤治疗提出了新的可能性，并为基于树突状细胞的细胞疗法提供了新的思路和依据。
本研究工作从深度、广度和技术路线都和两年前我们发表的肝癌T细胞工作有很明显的不同，但是又有着相辅相成的关系。
【基因慧】我们知道，目前常用的单细胞测序技术包括SMART-seq2和10x Genomics Chromium 3’等。课题组选择了整合这两个平台，可以和基因慧读者分享下在两个单细胞测序平台整合中，怎么样进行优势互补呢？
【文章共同第一作者何尧】之前我们侧重使用SMART-seq2测序技术，虽然数据质量非常高，但是实验成本很高。10x的高通量性以及较低的造价也让我们开始探索如何有效利用这些新型的测序技术。通过对两种类型的数据进行单独分析和整合分析，我们发现整合两种实验平台的数据能够充分发挥不同测序技术的优势，识别出仅在一种平台捕获的细胞类群，获得分辨率更高的肝癌免疫图谱。
例如，LAMP3+ 树突状细胞、CD14+单核细胞和FCGR3A+单核细胞仅在SMART-seq2数据中被识别，而先天淋巴细胞仅被10x数据捕获，数据整合后能够有效避免某一平台引起的细胞类型的偏差。同时，经过数据整合，10x数据中CD4+和CD8+ T细胞不易区分的现象也被SMART-seq2数据“补救”了，获得了较高的分辨率。
因此，我们认为，联合使用具有不同优势的单细胞转录组测序技术进行细胞异质性的研究或可成为相关研究的范式策略之一。
【基因慧】在肿瘤研究中，癌旁组织和外周血是常用对照组织。课题组在这次研究中首次收集了包括病理组织肝腹水在内的多组织位点。出发点是什么呢？首次操作过程中遇到的困难和解决过程，可以分享下吗？
【文章共同第一作者张启明】其实前面也提到过，由于越来越多的研究表明机体对抗肿瘤是一个全身性、系统性的生物学过程，而不仅限于肿瘤内部，因此，我们实验室在进行相关研究时一直关注肿瘤组织之外的自体对照的免疫特征，及其与肿瘤组织的联系。腹水是肝癌患者常见的病理现象，其产生与肝癌预后不良有关，然而腹水中的免疫细胞组成及其与肝癌的联系尚不清楚。
因此，我们进行多组织，包括病理组织在内的标本收集，希望对肝癌的机制有更深了解。就实验而言，首次进行处理时出现过很多困难，需要进行实验条件摸索，才能够成功获取其中的免疫细胞。解决过程就是不断尝试各种各样的实验条件，通过排除法找到最优条件。而数据分析方面，任老师和何尧花了很多心思和精力进行探索。
【文章共同通讯作者任仙文博士（北京大学副研究员）】癌旁组织和外周血作为对照组织是必要的，但不能充分揭示肝细胞癌的病理和免疫学特征。本次研究我们除了设置癌旁对照、外周血对照外，我们增加了腹水和淋巴结组织。产生大量腹水是重症肝细胞癌的一个重要临床特征，往往和预后不好相关联。腹水从哪里来，腹水里的免疫细胞从哪里来，和肿瘤有什么样的关系，对肿瘤的诊断和治疗有什么重要意义，这些都是未解决的生物医学问题。
我们应用单细胞测序技术分析腹水和肿瘤的关系，为解决这些问题提供了新的线索。我们发现腹水里的淋巴细胞和髓系细胞具有不同的来源，淋巴细胞的主要来源可能是外周血，而髓系细胞的主要来源是肿瘤。特别地，肿瘤中某类特殊的巨噬细胞倾向于从肿瘤迁移到腹水当中，这一结论我们从表达谱相似性、RNA降解速率分析、线粒体基因突变分析以及体外培养等角度进行了论证，为后续基于腹水的微创肝细胞癌免疫状况诊断提供了线索。
在本课题中我们另外增加的一个对照组织是淋巴结。虽然肝细胞癌不常发生淋巴结转移，但是淋巴结在免疫系统中扮演着重要的角色。淋巴结在肿瘤免疫中特别是肝细胞癌的免疫中扮演什么角色还不够清楚。此次淋巴结组织的增加使得我们发现了一群特殊的LAMP3+的树突状细胞。我们应用生物信息学分析、体外培养、刺激、迁移实验、免疫组化等不同手段证明了这群细胞的潜在功能，这一群细胞及其功能的发现对于深入理解肿瘤免疫具有重要意义。
【基因慧】 继上次合作一家药企后，我们看到这次北京大学生物医学前沿创新中心、生命科学学院、北京未来基因诊断高精尖创新中心和首都医科大学附属北京世纪坛医院、德国药企勃林格殷格翰公司联合参与课题，可否谈谈药企在其中的角色，以及未来系列研究的转化方向？
【张泽民教授】这是我们首次与勃林格殷格翰公司进行合作，是一次非常成功的合作。在实验和数据分析过程中，我们通过讨论交流，共同探索课题方向。特别是到项目后期，需要对分析结果进行生物学验证时，勃林格殷格翰公司的多位科学家和课题组都参与到其中，充分发挥他们的优势，完成了重要的实验验证，加强了本课题在免疫领域及应用转化方面的研究，从而升华了整个课题的意义。
在合作过程中，我们为了遵循中国遗传办关于中国遗传信息保护的新规定，避免了与国外合作方分享任何中国病人的临床信息以及遗传信息，而在科学思路和单个基因功能验证方面与其达到了有效的合作。我认为我们在充分保护中国遗传信息的基础上，通过多方密切联系，调动和整合各方资源，完成了本项研究工作。
由于我自己加入北大之前也是长期在药企工作，我深深地感到在药企工作的科学家对最急需的科学转化问题有着更直接的判断和把握，能够帮助我们抓到问题的重点。不过，我们选择的课题都是由北大主导的，知识产权也在中方。因为我们得到的科学进展都是“前竞争”(pre-competitive),我们的发现可以受益于国内外所有相关的制药企业。当然，我们的发现是相对基础的，离靶点发现和制药还有很远的距离，希望我们的发现能够对国内外相关药企理解和探索肿瘤免疫药物起到积极作用。
【文章共同通讯作者刘康博士（勃林格殷格翰公司主任科学家）】张教授与我们的本次合作可谓是一次高质量合作的范例。特别是在后期实验验证期间，我们频繁的进行讨论交流，充分挖掘后续值得深入探究的方向，包括重要的细胞类型、潜在的调控因子等。多方交流不仅能让我们较好地应对课题中出现的问题和困难，也为我们后续对新的调控因子进行追踪和跟进提供了便利。我们与张教授也继续进行合作，希望将来可以和大家分享成果。
【基因慧】 除了以上的信息，您还有其他需要和基因慧的科研和工业读者分享的吗？
【张泽民教授】相比于十年前，现在从基础研究到药物研发之间的转化时间越来越短，甚至可以说是齐头并进，因此把基础研究和转化研究紧密融合一直是我追求的科研模式。我认为本项目采取的产、学、研、医的几方面合作模式是双赢和多赢的模式，我们会继续这样的模式，把我们的技术和经验推广到更多的课题研究当中。
在此，我要再次感谢我们的合作方世纪坛医院的彭吉润课题组以及勃林格殷格翰公司的多位科学家。在项目初始阶段，我们在患者选择和临床需求上有一些困惑，通过和彭吉润研究组的同学通力合作，探索了整个项目的具体实施细节，包括病人入组条件、取样要求、单细胞转录组扩增方法等，从而保证项目的高效推进和运行。
项目后期勃林格殷格翰公司与我们一起进行的功能验证实验则进一步加强了本课题在免疫领域及应用转化方面的研究，从而进一步升华了整个课题的意义，这些对于整个课题的最终完成都有重要意义。
【彭吉润教授（北京世纪坛医院主任医师）】我们作为临床医生，对于目前存在的临床痛点可能有更精准的把握，通过与张教授的课题组积极沟通，取长补短，共同探索课题的发展方向，课题中的一些结果具有巨大的临床应用潜力。
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☆ 全国卫生产业企业管理协会精准医疗分会理事
☆ 参与组织发布《基因检测报告标准和规范共识》及团体标准
☆ 发布国内首个基因行业数据库YourMap和《基因行业报告》
☆ 精准医学出版工程《临床生物样本库的探索与实践》编委
☆ 广东省精准医疗应用学会政策研究应用分会常委、遗传病分会常委
☆ 主办首届数字健康私董会、粤港澳大湾区生命健康创新论坛
☆ 第九届中国深圳创新创业大赛盐田区决赛评委
☆ 受邀出席成都精准医学国际论坛、Illumina测序十周年等大会作行业报告
☆ 上海交通大学精准医疗EMBA协作单位
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